摘要：重组酶聚合酶扩增技术是2006年由英国科学家研发的一种核酸恒温扩增技术，它不同于传统的PCR扩增，恒温条件下短时间内实现靶基因大量扩增，具有恒温、快速、便携、灵敏度高、特异性强和操作简单等优点，具有广阔的应用前景。本文综述了RPA技术的原理、反应条件优化、产物检测方式、与其他恒温技术相比的优势及在禽病病原检测中应用，旨在为禽病病原检测新技术、新方法的研制提供参考。

关键词：重组酶聚合酶；扩增；恒温；禽病原；检测

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是2006年由英国科学家研发的一种核酸恒温扩增技术。它不同于传统的PCR扩增，不需要高温变性，不需要昂贵的仪器，而是利用多种酶参与，在体外模拟生物体内 DNA 复制，恒温条件下短时间内实现靶基因大量扩增，既可以扩增DNA，也可以扩增RNA。其基础反应体系与其他技术结合，衍生出多种核酸检测新技术，可以真正实现现场核酸快速检测。2014年，英国TwistDX公司推出了商业化的RPA检测试剂盒，有力的推动了该技术在农业、食品、医学以及生物学检测等多个领域的推广应用。RPA技术具有恒温、快速、便携、灵敏度高、特异性强和操作简单等优点，是目前唯一有望替代PCR技术的核酸等温扩增方法，在基层现场诊断中，具有广阔的应用前景。本文综述了RPA技术的原理、反应条件优化、产物检测方式、与其他恒温技术相比的优势及在禽病病原检测中应用，旨在为禽病病原检测新技术、新方法的研制提供参考。

1  RPA技术介绍

1.1　RPA技术原理

RPA等温扩增原理与T4噬菌体的DNA复制机制类似，主要利用噬菌体重组酶UvsX及其辅助因子UvsY、寡核普酸引物、单链核酸结合蛋白(SSB)，链置换DNA聚合酶，模板和MgCl₂在恒温下实现核酸扩增产物的指数增长，不需要高温热变性。重组酶与寡核苷酸引物结合，形成重组酶引物复合物，重组酶引物复合物扫描双链DNA，识别其中一条与引物序列互补的模板DNA并形成D环结构，SSB则与另一条单链DNA结合使之稳定。随后，在ATP作用下重组酶与引物解离，D环消失，引物3′端暴露，在DNA聚合酶作用下，3′端开始延伸扩增，2条引物同时启动和完成合成过程，不断重复整个过程，目标产物迅速呈指数增长，一般20 min内即能完成扩增反应。

1.2　引物设计及反应条件

RPA反应所用的引物不同于常规PCR引物，RPA扩增目的片段长度一般不超过500 bp，100～200 bp扩增效果好，片段过长、重复序列过多则会降低RPA扩增的准确性。RPA引物设计无专门软件，但引物设计有一些基本原则可遵循，引物序列的长度最好在30～35 bp，引物过短会降低反应重组率，引物过长则有可能形成二级结构。5′端3～5个碱基避免出现G，3′端最后3个核苷酸最好是G或C，GC含量应在30%～70%之间，核酸内部不要有单核苷酸重复或小重复序列，不需要考虑引物退火温度。引物的浓度范围在400～500 nmol/L之间。

MgCl₂是RPA反应的启动因子，反应体系一旦加入MgCl₂，即开始扩增反应，MgCl₂浓度通常为12～20 nmol/L。25～45℃恒温条件均能进行RPA反应，但最佳温度为37～42 ℃，温度低于30 ℃出现假阳性的几率增加，并降低酶活性。因RPA反应需要多种酶参与，扩增反应开始前各试剂一定要充分混匀，各反应试剂45 ℃下3周内不会降低试剂的活性。

1.3　产物检测及衍生技术

RPA扩增产物的检测方法有多种， 目前常用的有3种， 即凝胶电泳法、 实时荧光RPA（RT-RPA）检测法及横向流动试纸条检测法等。凝胶电泳法所需仪器设备简单、成本低，但电泳前需要纯化扩增产物，否则会有拖尾现象。产物纯化和凝胶电泳增加了检测时间。

　　RT-RPA检测时需要额外设计1条exo探针，exo探针的长度约46～52 bp，内部有一个碱基类似物(THF或dSpacer)替代靶序列中的A或T，碱基类似物距离5′至少30 bp，距离3′至少15 bp，碱基类似物两侧的T上分别标记荧光基团和淬灭基团，探针结构完整时荧光强度低，探针与靶序列结合时，连接荧光基团和淬灭基团的碱基类似物被核酸外切酶降解，淬灭基团被释放，荧光基团发出荧光。3′端进行封闭修饰（可用C3-spacer，磷酸基团、生物素或胺基），以阻止探针充当引物进行扩增反应。与荧光PCR方法类似，需要配备荧光检测设备，通过荧光信号强弱实现扩增产物定量检测，可实现多重检测，但终产物不能再用电泳方式检测，因扩增产物在反应结束时会被降解。5～15 min即可完成检测反应，产物不需要开盖检测。

横向流行试纸条检测，需要额外设计1条nfo探针，并在其下游引物在5′端标记生物素(Biotin)，探针的长度约46～52 bp，探针上游标记异硫氰酸荧光素 (FITC)或6-羧基荧光素(FAM)，中间位置采用THF替代一个碱基，3′端进行磷酸化处理。探针长度过短会降低重组率，过长会有非特异性扩增，通常探针浓度为120 nmol/L。扩增反应不需要复杂设备，产物检测前需要20倍稀释，室温下5 min内可完成检测反应，但如果不稀释扩增产物容易出现假阳性结果，结果读取时间超过5 min也容易出现假阳性，扩增产物也可以直接电泳检测。与胶体金检测抗原类似，在检测线上形成“生物素抗体一核酸一纳米金粒”复合物显色。质控线上包被抗FITC或FAM抗体的固定抗体，可直接与带FAM抗体的纳米金颗粒结合，在质控线上显色，以确保试纸条的有效性。裸眼可观察结果，对检测人员要求低，可用于非实验室环境的现场检测。

1.4　RPA与其他恒温扩增技术相比的优势

目前核酸恒温扩增技术主要有依赖核酸序列扩增技术(NASBA)、滚环式等温扩增技术(RCA)、依赖解旋酶等温扩增技术(HDA)、多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)、单链介导RNA扩增技术(SMART)、环介导等温扩增技术(LAMP)、RPA等。这些方法都有各种缺点和不足，如NASBA一般用于RNA的扩增，对DNA扩增前仍需进行高温变性，NASBA反应所需酶热稳定性较差。RCA所需模板必须是单链环状DNA，扩增时间长。SDA扩增反应开始前需要变性，扩增产物电泳检测有拖尾现象，且不能直接克隆。MDA、HDA扩增反应时间长，仅能用于DNA样本扩增。SMART操作复杂、反应时间长。LAMP所用引物设计复杂，易造成假阳性结果，扩增片段一般在200～300 bp。相对来说RPA是最佳的恒温扩增法，可在较低温下恒温扩增，不需要复杂仪器设备，操作简单、反应时间短，特异性好、灵敏度高，可采用电泳、荧光、侧向流试纸等多种方式检测扩增产物。

2　RPA技术在禽病病原检测中的应用

2.1　禽细菌检测

王金凤等根据单增李斯特氏菌LMhly A基因保守序列，设计RPA引物和exo探针，建立一种快速检测单增李斯特氏菌的RT-RPA方法，该方法能够在37 ℃等温条件下20 min内完成扩增。特异性好，对其他20种致病菌基因组DNA的扩增均为阴性。以纯培养菌液的基因组DNA进行10倍梯度稀释作模板，其灵敏性可达到5×10^-1 pg，与实验室已建立的荧光 PCR方法一致。刘立兵等根据产气荚膜梭菌保守的plc基因，设计引物和探针，建立了产气荚膜梭菌的RT-RPA检测方法。结果显示，该法检测限为1.3 pg/μL产气荚膜梭菌DNA。在人工污染模拟样品的检测中，检出限均为1.0×10² CFU/mL， 3～13 min即可实现对样品的检测。在检测时间、操作方便性和仪器便携性方面，明显优于荧光PCR方法。高建欣等将RPA与乳胶微球试纸条(LMTS)相结合的方法，快速检测金黄色葡萄球菌。根据金黄色葡萄球菌保守的nuc基因设计特异性引物，经RPA扩增后用LMTS检测，确定RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和特异性。灵敏度结果显示RPA-LMTS检测限为500 fg DNA和1.2×10¹CFU/mL纯菌液，特异性结果表明与沙门菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌、产气肠杆菌和单增李斯特菌无交叉反应，特异性良好，用食物样品评估RPA-LMTS检测效果，结果显示， 经过增菌3 h后， RPA-LMTS可检测1.2×100 CFU/mL(g)的金黄色葡萄球菌。程辉等以沙门菌特异毒力基因fimY和细菌耐药相关1类整合酶基因intI1为靶标序列，设计特异性RPA引物与exo探针，建立了一种能单管同时快速鉴定沙门菌及其耐药相关1类整合酶基因的双重RT-RPA方法。结果显示，反应体系中最佳引物浓度为fimY 320 nmol/L，intI1 400 nmol/L，fimY 60 nmol/L，intI1 100 nmol/L，在温度37℃恒温下20 min可完成检测反应。该法特异性好， 对副溶血性弧菌、 志贺氏菌、 金黄色葡萄球菌、 β溶血性链球菌、 单增李斯特菌、 阪崎肠杆菌基因组DNA扩增结果均为阴性，灵敏度试验显示，沙门菌检测灵敏度为1.29×10¹ CFU/mL，intI1检测灵敏度为1.60×10¹CFU/mL。Geng等根据空肠弯曲杆菌hipo基因设计引物和exo探针，成功建立了检测空肠弯曲杆菌的RT-RPA检测方法。结果显示，该法在恒温条件下13 min内可完成检测反应，可在人工污染的乳和鸡胸肉样品中检测空肠杆菌，效果好。

2.2　禽病毒检测

Yehia等根据H5亚型禽流感病毒血凝素基因设计引物，建立了检测H5亚型禽流感病毒的RT-RPA检测方法，该法可在7 min内完成检测，检测限度为1个拷贝的RNA分子，与荧光PCR检测敏感性相当，方法特异性好，不与引起家禽呼吸道症状的其他病原核酸发生交叉反应。Abd El Wahed等分别根据H7N9的HA和NA基因设计引物，建立了检测H7N9禽流感病毒的RPA方法，该法在42 ℃恒温条件下7 min内可完成检测反应，对H7和N9 的检测敏感性分别为10和100个RNA分子，而对影响人类或鸟类的任何其他呼吸道病毒检测结果均为阴性。所有试剂均可在室温环境下贮存和运输，设备为太阳能电池驱动，适合临床样品的现场快速诊断。马国和等联合RPA和侧向流试纸条(LFD)技术，在优选的RPA上、下游引物的5′端分别进行FITC和Biotin标记，通过引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化建立了一种可以用于ILTV现地检测的RPA-LFD方法。该检测方法在30～42.5 ℃恒温反应20 min即可实现对ILTV目的基因片段的有效扩增，与其他常见禽病病原DNA无交叉反应，RPA扩增产物直接用胶体金侧向流免疫层析试纸条肉眼观察，最低检测限为100拷贝/μL，比常规PCR灵敏度高100倍。王潇等对A型流感病毒M基因序列设计引物及探针，建立了一种灵敏度高、特异性强、检测迅速和操作简便的A型流感病RT-RPA。结果显示，该方法特异性强，只有A型动物流感病毒呈阳性，其他相关常见病原均为阴性，反应时间短，仅需20 min，灵敏度高，最低可检测到病毒核酸浓度为0.96×10^-2 μg/mL。万文妍等针对FAdV-4 hexon基因设计特异性RPA引物，上、下游引物的5′端分别进行FAM和Biotin标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件优化，建立了一种可用于FAdV-4现场检测的RPA-LFD方法。该方法在25～45 ℃恒温15 min可实现对FAdV-4目的基因有效扩增，产物用胶体金侧向流试纸条检测，检测结果肉眼可见。最低检测限为100拷贝，敏感性是常规PCR的100倍，且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。

3  小结与展望

RPA技术自开发以来，深受广大科研工作者欢迎，在生命科学领域得到广泛应用，并衍生出许多新技术，成为恒温核酸扩增技术的主流，也是最有希望取代PCR的核酸扩增技术。RPA不受场地的限制，不需要昂贵仪器，对温度要求低，恒温扩增，时间短，可以在资源匮乏地区实现快速检测的目的，目前已广泛用于食品安全及动物疫病检测，但国内就PRA技术在禽病病原检测中的研究并不多。RPA作为一种新兴起的检测技术，也存在着一些缺点和不足。RPA主要利用多种酶实现核酸扩增反应，任何一种酶失活可致扩增失败，因扩增体系存在大量蛋白酶，需去除蛋白后才能电泳或后续试验。不能扩增超过500 bp的目的基因，RPA所用试剂均来自英国TwistDx公司，单份检测费用高。引物要求高，无专门设计软件，仅有筛选原则，需通过手动方式进行大量引物筛选，优化反应体系，增加研发时间和费用。未来RPA技术可能在以下方面进一步突破：①研发专门引物设计软件，降低引物设计难度。②反应温度范围拓宽，不局限于某一温度，可在某温度范围内完成扩增反应。③实现多重检测，结果判定更简便直观。④可扩增长片段核酸。⑤研发出低廉、高效的酶制剂，降低成本。相信随着技术不断进步，势会引起一场核酸检测的革命，取代PCR技术在分子检测中的霸主地位，在禽病病原的现场检测中发挥更大的作用。

（作者：于新友，工作单位：山东绿都生物科技有限公司，来源：《养禽与禽病防治》2019年第10期）