两种虎红平板凝集试验检测羊布鲁氏菌病效果比较学术天地

两种虎红平板凝集试验检测羊布鲁氏菌病效果比较

摘要：为比较常规和改良虎红平板凝集试验（RBPT）的羊布鲁氏菌病检测效果，对239份免疫、非免疫场绵羊和阴性绵羊血清进行检测，并通过竞争ELISA试验（cELISA）和试管凝集试验（SAT）进行确诊。结果显示：常规RBPT检测非免疫血清的敏感性为68.85%，特异性为93.55%，与cELISA的符合率为77.17%；检测免疫羊血清的敏感性为75.81%，特异性为73.33%，与cELISA的符合率为75.00%。改良RBPT检测非免疫羊血清的敏感性为91.80%，特异性为70.97%，与cELISA的符合率为84.78%；检测免疫羊血清的敏感性为98.39%，特异性为10%，与cELISA的符合率为69.57%。两种RBPT和cELISA的阴性血清检测结果全部为阴性，符合率为100%。结果表明：改良RBPT法的敏感性要高于常规RBPT法，可以在阳性羊群中筛选到更多抗体效价较低的早期感染动物。但其特异性有一定程度的降低，必须结合SAT、cELISA等特异性高的方法进行确诊。本研究为羊布鲁氏菌病检测方法的选择提供了参考。

布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌属细菌引起牛、羊、猪、鹿、犬等多种哺乳动物和人类共患的一种传染病，为我国二类动物疫病。布病全球流行，已有170多个国家有人间和畜间布病病例的报道。动物布病以母畜流产和公畜睾丸炎为主要特征；人布病以发热、乏力、流产、睾丸炎等为主要症状，严重影响患者的生活质量，甚至丧失劳动能力和生育能力。该病严重影响畜牧业发展和人类健康。根据中国疾病预防控制中心公布的统计数据，2019年我国人间布病新增病例44036例，发病率高达3.1/（10万），同2018年的新增病例数相比增加了16%。

我国现行的动物布病诊断技术标准（GB/T 18646—2018）规定了多种布病血清学检测方法，如虎红平板凝集（RBPT）、试管凝集（SAT）、间接ELISA（iELISA）、竞争ELISA（cELISA）和补体结合（CFT）等试验方法。其中，RBPT操作简单、试剂便宜、试验耗时短，在基层兽医实验室的动物布病检测中应用非常广泛。但该方法也存在一定的缺陷：敏感性低于ELISA、荧光偏振（FPA）、CFT和胶体金；特异性也不高，需用SAT、ELISA或CFT等进行确诊。世界动物卫生组织（OIE）在发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中推荐了一种改良的RBPT方法，用于对小反刍兽血清样品检测，即使用3倍血清与1倍虎红平板凝集抗原混合进行检测。而我国现行的诊断技术标准（GB/T 18646—2018）中的RBPT方法，则是使用等量的动物血清与虎红平板凝集抗原混合进行检测。为评价这两种RBPT方法对羊血清的布病检测效果，采用两种RBPT方法，对来自免疫羊场、非免疫羊场和布病阴性羊群的239份血清样品进行了检测，同时以cELISA和SAT进行符合检测。

材料与方法

血清样品

免疫场、非免疫场的绵羊血清各92份，采自内蒙古自治区，其中免疫场血清为S2疫苗注射免疫10个月后采集。阴性绵羊血清55份，采自辽宁省和河北省的阴性羊群。

方法

常规RBPT、SAT（微量法）和cELISA试验，均按照我国动物布病诊断技术标准（GB/T 18646—2018）进行。改良RBPT试验，按照OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中检测小反刍兽疫的RBPT方法，使用75 μL羊血清和25 μL RBPT抗原混合4 min后观察结果。

对免疫、非免疫和阴性绵羊血清的两种RBPT检测结果进行敏感性和特异性对比，并以cELISA为“金标准”进行符合率对比。同时，对常规RBPT、改良RBPT和cELISA检测结果不一致的样品，采用SAT（微量法）进行验证。

结果

RBPT检测

在239份羊血清检测中，用常规RBPT检出44份非免疫场、55份免疫场阳性血清，而用改良RBPT分别检出65、88份。55份阴性血清均为阴性（表1）。

cELISA检测

采用cELISA检测239份羊血清，结果检出61份非免疫场、62份免疫场阳性血清，55份阴性血清全部为阴性（表2）。

对比分析

在检测非免疫场羊血清样品时，常规RBPT的敏感性为68.85%（42/61），特异性为93.55%（29/31），与cELISA的符合率为77.17%（71/92）；在检测免疫场羊血清样品时，敏感性为75.81%（47/62），特异性为73.33%（22/30），与cELISA的符合率为75.00%（69/92）。

在检测非免疫场羊血清样品时，改良RBPT的敏感性为91.80%（56/61），特异性为70.97%（22/31），与cELISA的符合率为84.78%（78/92）；在检测免疫场羊血清样品时，敏感性为98.39%（61/62），特异性为10%（3/30），与cELISA试验的符合率为69.57%（64/92）。

在检测55份阴性血清时，两种RBPT和cELISA检测全部为阴性，符合率为100%。

SAT验证

对33份常规RBPT检测为阴性，而改良RBPT和cELISA检测均为阳性的样品，采用SAT法（微量法）进行验证，结果可疑的16份，阳性的5份（表3）。

讨论

20世纪50年代，布病曾在我国广泛流行。随着防控力度的不断增强，20世纪80—90年代，我国布病疫情降至历史最低水平。然而，2000年以来，随着我国家畜饲养量不断增加，动物及其产品流通频繁，部分地区布病暴发呈持续上升势头，严重威胁了畜牧业生产和人民群众的身体健康。2013—2017年，国家动物布病参考实验室对有流产症状的布病非免疫牛场采集血清样品进行检测，结果布鲁氏菌血清抗体平均个体阳性率高达44.2%。

根据《国家布鲁氏菌病防治计划（2016—2020年）》的相关要求，实验室检测也是畜间布病防治的重要技术措施，县级动物疫病预防控制机构应具备开展布病血清学检测能力，省级动物疫病预防控制机构应能有效开展布病病原学检测工作。因此，家畜布病诊断技术研究对于布病防控具有重要意义。

本研究比较了常规RBPT和改良RBPT对羊血清样品的检测情况，同时按照我国现行动物布病的诊断技术标准（GB/T 18646—2018），采用cELISA和SAT进行确诊，结果改良RBPT比常规RBPT多检测出33份cELISA检测阳性样品，其中16份经SAT判定为可疑，5份判定为阳性，没有出现RBPT检测为阴性而常规RBPT检测为阳性的样品，说明改良RBPT在检测羊血清样品时的敏感性要高于常规RBPT。因此，用改良RBPT在存在阳性动物的羊群中开展检测，更容易筛选到抗体滴度较低的阳性动物，从而减少漏检率。

特异性方面，在检测非免疫场和免疫场血清样品时，改良RBPT都低于常规RBPT。值得注意的是，当使用改良RBPT检测免疫场的羊血清样品时，该方法的特异性仅为10%，这与采用该方法对55份阴性羊场的血清样品检测无假阳性出现的结果存在较大差异。对cELISA试验原始数据的进一步分析表明，27份cELISA检测为阴性而改良RBPT检测为阳性的免疫场羊血清中，有19份抑制率介于20%~30%。由于本研究免疫场的羊血清样品为S2疫苗注射免疫10个月后所采集，此时大部分免疫羊的布病免疫抗体刚好降低到cELISA检测临界值之下（抑制率小于30%），所以采用cELISA检测时为阴性。

结论

　　综上所述，改良RBTP的敏感性要高于常规RBPT，可以在阳性羊群中筛选到更多抗体效价较低的早期感染动物。但改良RBTP特异性有一定程度的降低，必须结合SAT、cELISA等特异性高的方法进行确诊，以避免对假阳性动物的“误杀”。

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