几种布鲁氏菌病检测方法比对结果分析
时间：2022-12-24
摘要：为比较几种常用布鲁氏菌病（简称布病）检测方法特性，在某疫苗免疫的奶牛场随机选取40头奶牛，采集血清和奶样各40份，然后对采集的血清进行虎红平板凝集、试管凝集、胶体金、酶联免疫吸附试验（iELISA和cELISA）和琼脂扩散方法检测，对采集的奶样进行病原学检测（qPCR）和抗体检测（胶体金）。结果显示：4种国标方法（虎红平板凝集、试管凝集、iELISA和cELISA）检出的阳性样品数量有较大差距，分别为16、6、23和33份，其中经试管凝集试验检出的阳性血清，经其他3种国标方法也检测为阳性；通过胶体金法检出阳性血清数（9份）略高于试管凝集试验，且血清及牛奶样品经胶体金检测结果基本一致；琼扩法检出12份阳性血清，且显示抽检奶牛中存在野毒感染；qPCR和胶体金试纸条对采集奶样的检测结果有较大差距，经qPCR检测仅1份样品呈阳性。结果表明：国标方法中，试管凝集试验特异性最高，iELISA和cELISA敏感性较高；病原学检测临床样品检出率较低，琼脂扩散试验敏感性有限，胶体金法敏感性适中，操作简便，适合布病免疫奶牛场自检。本研究为牛场布病不同检测目的方法选择提供了参考。布鲁氏菌病（brucellosis，简称布病）是一种流行范围广、危害严重的人兽共患病。目前有60多种动物可以作为布病储存宿主。该病一年四季均可发生，流产为其典型发病症状。该病曾在20世纪50至70年代在国内大范围流行，此后经过严格控制，在80年代保持了较低流行率。然而，从90年代开始该病发病率又明显上升，现在已成为影响畜牧业和公共健康的重要危害之一。目前我国大陆地区的所有省级地区都有布病病例报道。在布病流行严重的地区，往往采用疫苗免疫进行防控。目前主要使用A19、S2和M5等弱毒株活疫苗。其中A19弱毒株疫苗被广泛采用，其有效期长，使用6×109 CFU活菌的标准计量或稀释10倍剂量的疫苗预防牛布病，均可以达到较好的免疫效果，免疫有效期可达72个月。A19疫苗株与国际上普遍使用的S19疫苗株同源性非常高，而后者是目前世界公认的防控奶牛布病最有效的疫苗株。病原分离是诊断布病的金标准，但病原分离率低，分离条件严格，不便于普遍应用。血清学诊断是布病筛检和确诊的主要临床诊断方法。国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB 18646—2018）中的免疫学检测方法包括虎红平板凝集、试管凝集、间接酶联免疫吸附试验（iELISA）、竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）和补体结合试验等。其他免疫学检测方法包括胶体金和荧光偏振。病原学检测方法包括PCR和qPCR。疫苗在提供保护的同时，也为布病的确诊增加了困难。由于缺乏便捷有效的区别诊断方法，免疫牛群中自然感染牛和免疫阳性牛很难区分。本研究针对某免疫过A19株疫苗的奶牛场，采用多种检测方式开展平行检测。通过比较多种方法的检测结果，分析该场是否存在野毒感染，同时比较不同方法的检测特性。40份血清样品和40份牛奶样品，于2020年5月收集自某奶牛场4头未免疫奶牛和36头免疫A19株疫苗的奶牛。奶牛年龄、胎次以及距离最后一次免疫时间详见表1。虎红平板凝集试验、试管凝集试验、cELISA、iELISA，均按照国标（GB 18646—2018）操作。抗体琼脂扩散（琼扩）试验基于布鲁氏菌野毒株和疫苗株的表面抗原差异，可区分被检动物是否存在野毒感染。血清中抗体与相应抗原在琼脂胶中扩散，相遇后会结合形成沉淀线。试剂中的抗原包含一种布鲁氏菌中普遍存在的脂多糖（LPS）和一种野毒株表面的多糖类半抗原（NH）。检测时，在琼脂胶中央孔里加入抗原，在周边孔中加入阴阳性对照和血清样品，室温静置24~48 h。若无沉淀线且对照成立，则认为动物无感染或免疫；若只出现LPS的沉淀线，则被检动物很可能仅免疫未感染；若出现两条沉淀线，则认为被检动物存在野毒感染。吸取5 µL血清样品滴入间接法胶体金试纸条加样孔中，10~20 min观察结果。当对照线和检测线同时出现，则认为样品为阳性。另用相同试纸条检测牛奶样品，方法同上。引物 采用荧光定量PCR（qPCR，探针法）对牛奶中布鲁氏菌进行检测。首先建立布鲁氏菌属（BSSP）和牛种布鲁氏菌（BA）的标准曲线。BSSP作为通用引物，可检测所有种的布鲁氏菌，起到双重检测目的，从而保证阳性结果的准确性。引物信息详见表2。奶样处理 吸取10 mL采集的奶液加入3%柠檬酸钠-磷酸缓冲液，振荡混匀，3 000 r/min离心30 min；用移液器将表层脂类及上清弃去，留下沉淀；加入PBS缓冲液（pH7.6），振荡混匀，转移至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心10 min，弃上清，将沉淀保留下来；按照试剂盒说明书操作提取核酸，反应条件为95 ℃变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。多份样品在不同检测方法中显示出不同的阳性判定，结果见表3。4种国标方法检测出的阳性样品数量有较大差距。虎红平板凝集试验检出阳性样品16份，阳性率为40.0%；试管凝集试验检出阳性样品6份，阳性率为15.0%；cELISA和iELISA方法分别检出阳性样品33和23份，阳性率分别为82.5%和57.5%。其中，试管凝集试验检测的阳性血清（样品1~6号），经其他3种国标方法检测也为阳性。胶体金试纸条共检出9份阳性血清（样品1~9号），阳性率略高于试管凝集试验。其中，样品1~4号被所有血清学检测方法判定为阳性，样品5~7号被胶体金试纸条以外的4种血清学方法判定为阳性，样品8、9号被虎红平板凝集试验、iELISA和cELISA 3种血清学方法判定为阳性。在牛奶样品检测中，胶体金试纸条检测出10份阳性样品，与同方法的血清学结果基本一致。对于所有经虎红平板凝集、试管凝集试验检测为强阳性的样品以及经琼扩法判定为野毒感染的试验牛，其奶样经胶体金试纸条检测也均呈阳性。琼扩法检测结果显示，有12份阳性血清，其中7份是免疫阳性，5份为野毒感染。没有出现琼扩法单一检测为阳性的血清样品。琼扩法检测为野毒阳性的样品中，除1份样品为iELISA阴性外，其他均被所有血清学方法证实。当琼扩法检测出现野毒抗体沉淀线时，可认为该样品存在野毒感染。但琼扩法在具有高度特异性的同时，也损失了一定的敏感性，尤其是在读取结果时，经常发现沉淀线不够清晰或者培养48 h后才能够勉强观察到沉淀现象。在本次检测中，有3份琼扩法检测为阴性的样品（样品6、8、9号）被其他多种方法却认定为阳性。BSSP qPCR标准曲线建立 目标基因插入pUC57质粒。以3.47×108 拷贝/μL进行10倍梯度稀释，获得标准曲线方程Y = -3.12X+45.5，R² = 0.991 2（图1），具有良好的线性关系。BA qPCR标准曲线建立 目标基因插入pUC57质粒。以6.34×108拷贝/μL进行10倍梯度稀释，获得标准曲线方程Y = -3.43X+32.4，R² = 0.997 3（图2），具有良好的线性关系。qPCR检测 对采集奶样进行qPCR检测，结果只有1份呈现BSSP和BA阳性。未免疫牛共采集血清4份（样品15、21、35、36号），在琼扩法、iELISA和cELISA检测中，有2份样品（样品15、21号）分别被2种方法检测为阳性。在本研究中，不同方法表现出了不同特点。试管凝集试验比虎红平板凝集试验显示出更高的特异性，这也正是虎红平板凝集试验作为初筛，试管凝集试验用以确诊的原因。本研究中，试管凝集和虎红平板凝集试验均显示为强阳性的样品（样品1~4号），其他血清学方法也显示为阳性，且琼扩法显示存在野毒感染。但是试管凝集试验操作繁琐，等待时间长，而且需要符合要求的实验室环境。虎红平板凝集试验虽然操作简便，但是对检测人员的经验有一定要求，实际检测工作中，对同样的结果经常出现不同的判读标准。虽然没有采用细菌分离鉴定的金标准，但是根据多种方法的检测结果，可以确定本牛场存在野毒感染。通常情况下，奶牛的免疫抗体在6个月后就无法检出。然而，本场奶牛免疫时间均超过一年，很多血清样品仍可以检出抗体阳性。这可能是由于本场存在野毒感染且排菌的动物，持续刺激其他免疫奶牛保持抗体存在。为了最大程度且成本可控的降低风险，一种简便可信的鉴别野毒感染方法就显得尤为重要。
琼扩法虽然能够直接指明免疫动物中是否存在野毒感染，但是其检测成本较高，敏感性有限，对检测人员的操作经验也有一定要求，难以在牛场普及。iELISA和cELISA的敏感性过高，疫苗免疫抗体会严重影响检测结果。本研究中，有7份血清样品仅在两种ELISA方法中显示为阳性（样品21~27号），另有6份（样品28~33号）仅在cELISA中显示为阳性。ELISA方法可以敏感地发现疫苗抗体，但在免疫场判断是否存在野毒感染时，几乎不具有参考性。qPCR有很好的特异性，但是对实验环境、操作、设备都有较高要求，而且样品中的病原含量可能很低，在不分菌培养的情况下，往往很难直接捕捉到病原核酸。在本研究中，仅有1份奶样在qPCR方法检测中显示为阳性。间接法胶体金试纸条在本次试验中展示出了较好的参考价值，其所有血清检测阳性的样品被至少3种其他方法所支持，而且对奶样检测时，也表现出了与血清学方法良好的符合度，在生产现场具有很好的应用价值。这是因为对于产奶期的奶牛无需采血，减少了对动物的刺激，挤奶时可以当场检测，操作简单、结果清晰。针对免疫过的奶牛，目前没有一种简便有效鉴别野毒感染的方法。但是通过对几种检测方法的比较分析，间接法胶体金试纸条显示出了较好的参考意义和方便的操作性。对于布病免疫奶牛场，可以在不采血的情况下，通过奶样快速筛查出存在布鲁氏菌感染风险的牛，然后及时对其隔离观察，送样品到当地动物疫控部门检测，做好人员防护和无害化处理工作。
